Invitrogen核/膜系统 一、 实验原理： 真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由DNA结合结构域(DNA—binding domain，BD)和转录激活结构域(activation domain，AD)。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，购买重庆酵母单杂交文库技术服务,郑州医药、保养，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。在GAL4系统中构建与基因的ORFs融合的激活结构域GAL4-AD的特异载体，顺式作用元件与GAL4的DNA结合结构域GAL4-BD融合构建载体，分别转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若与顺式作用元件发生相互作用时，就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起，高品质重庆酵母单杂交文库技术服务,西北医药、保养，重庆酵母单杂交文库技术服务,更实惠医药、保养，从而与上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)结合，激活相应报告基因的表达，在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。基因转录实际上是转录调控因子和启动子区各种顺式作用元件相互作用的结果，这种结合犹如蛋白质与蛋白质的互作一样具有特异性，这是研究顺式作用元件即DNA序列与蛋白质互作的基础。 实验步骤： 1.1 RNA提取 1.2 mRNA分离 1.3 cDNA初级文库的构建 1.3.1 cDNA一链的合成 1.3.2 cDNA第二链的合成 1.3.3 cDNA adapter的制备 1.3.4 cDNA与attB1重组接头连接(三份接头各连一份) 1.3.5 cDNA分级分离 1.3.6 BP重组 1.3.7 电转化大肠杆菌DH10B 1.3.8 文库克隆检测 1.3.9 文库库容量、重组率、插入片段长度鉴定 1.4 cDNA次级文库的构建 1.4.1 初级文库的质粒抽提 1.4.2 LR重组 1.4.3 电转化大肠杆菌DH10B 1.4.4 文库克隆检测 1.4.5 文库库容量、重组率、插入片段长度鉴定 三、实验结果： 次级文库库容大于107，重组率大于90%，西安淳风生物科技有限公司,西安淳风生物科技有限公司,平均插入片段大于1kb。 酵母单杂交技术最早是1993年由Li等从酵母双杂交技术发展而来，通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相互作用的敏感性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的、用生化手段难以纯化的特定转录因子。 酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。其理论基础是:许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD)组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。

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