▼背景说明蛋白互作在细胞生命活动中起着关键作用,在不同时空层面上参与多种细胞过程,因此研究蛋白互作对于理解分子调控网络至关重要。通常情况下,利用酵母双杂交系统筛选植物蛋白互作必须利用体外和体内系统进行验证!Pull-down就是验证植物蛋白互作的常用技术，被广泛用于体外验证蛋白间的直接互作.▼应用场景Pull-down技术,也叫蛋白质体外结合实验,是一种行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术.▼实验原理将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽标记的珠子上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液与之孵育,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,诱饵蛋白和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

　　C！孵育蛋白：将GST融合蛋白裂解液加入洗涤后的GST-sepharosebeads中!4℃震荡孵育1小时！D！收集beads:5000rpm离心30秒，两次，沉淀beads！E。清洗beads:吸出上清，用1mLBC500缓冲液（含1%TritonX-100，不含蛋白酶抑制剂）清洗beads3次!5000rpm离心30秒，两次，沉淀beads!F.清洗beads:以1mLBC100缓冲液（含0。1%TritonX-100，不含蛋白酶抑制剂）清洗beads3次。

　　5000rpm离心30秒，两次，沉淀beadsG.以300µLBC100缓冲液重悬beads（含0.1%TritonX-100）!His融合蛋白的纯化：采用His-taggedproteinpurificationMagbeads（Absin,中国）进行His融合蛋白的纯化，按照制造商的使用说明进行操作！A。取0!3mL的磁珠，磁性分离，washingbuffer清洗3次.B.细菌裂解液加入磁珠中，4℃震荡孵育1小时，washingbuffer清洗3次，每次清洗后均磁性分离磁珠。

银川GST-pull down公司

　　在Pull-down实验中,设计恰当的对照实验非常重要,该对照可以是表达有GST(非诱饵融合蛋白)的转化细胞裂解物,也可以是将GST加到非转化细胞的裂解物中。GST融合蛋白Pull-down的方法可以用来鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质,也可以鉴定2个已知蛋白质之间是否存在相互作用。此方法简单易行,操作方便！但Pull-down的结果并不能真实的反应蛋白质之间的相互作用,因为在活体内它们不一定在亚细胞空间上能碰到,所以并不意味着在生理条件下一定结合！

　　 西安淳风生物科技有限公司在其他生物制品这个行业中，是一家屈指可数的好公司。其主营的产品——蛋白质体外结合实验（GST pull-down 技术），更是在业界中受到广大客户的喜爱。

　　GST-Pulldown是在体外验证两种蛋白质结合的方法之一，其原理是目的蛋白与GST融合表达，蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支持物，起到“诱饵蛋白”的作用。目标蛋白溶液通过柱子，从中可以捕获相互作用的“捕获蛋白”（目标蛋白）。结合物洗脱后，通过蛋白质印迹(WB)分析证实了两种蛋白质之间的相互作用。“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”都可以通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录和翻译系统获得，这种方法简单易操作。

　　C。在磁珠中加入400µLElutionbuffer，室温震荡2分钟，磁性分离收集洗液.反复3次！D.将3次中收集到的液体用10K的超滤管进行浓缩，5000g，离心15分钟，加入500µLBC100缓冲液进行缓冲液置换，5000g，离心15分钟，收集到50-100µL浓缩蛋白。蛋白结合及检测：A!纯化蛋白结合：向GST及GST-DNMT3Lbeads中分别加入10µLHis-USP46纯化蛋白，4℃震荡孵育1小时，5000rpm离心30秒，两次，沉淀beads！

　　为了不破坏细胞内存在的蛋白与蛋白之间的相互作用,多采用非离子变性剂(NP-40或TritonX-100),不能采用高浓度的变性剂(0！2%SDS),细胞裂解液中要添加各种酶的抑制剂!（16）超声破碎,频率:100~200瓦;超声40秒,停止20秒,共5次(菌体由浑浊变为澄清);（17）4°C,15000rpm离心40分钟;（18）冰上转移细胞裂解液上清至洁净的10mL离心管中;（19）在细胞裂解液上清中加入50μL50%GlutathioneSepharose4B,4°C,静音混合器上温和旋转孵育30–60分钟;（20）3000rpm离心5分钟,弃上清,此时Sepharose上即结合了GST融合蛋白或GST;（21）在管中加入预冷的500μLPBS(沿壁加入,动作轻柔,以免打断珠子与蛋白的联接),轻晃悬浮珠子,将Sepharose洗涤1次,3000rpm离心3分钟,弃上清;（22）反复用PBS洗涤3次(最后用小枪吸净珠子表面水膜),即获得结合有GST融合蛋白或GST的Sepharose,用大口径的移液枪头转移至5mL尖底离心管中;（23）如果用于检测,在Sepharose加入15–20μL1xSDS蛋白上样缓冲液,在沸水中煮3分钟,12000rpm离心1分钟,取上清作SDS-PAGE电泳;（24）如果用于Pull-down检测,继续后续操作!

　　西安淳风生物科技有限公司坐落于陕西省西安市雁塔区长安南路86号澳城大厦，是陕西西安雁塔区知名企业，公司业务联系人：17791388172， 期待您的来电咨询更多关于GST-pull down相关信息！