B!吸出上清!以1mLBC100缓冲液（含0.1%TritonX-100）清洗beads3次！C。加入1xloadingbuffer50µL，连同input样本，95℃金属浴5min！离心分离beads，取上清进行Westernblot检测。将表达GST融合蛋白（实验组）和GST（对照组）的质粒分别转入BL21菌株中！分别挑取阳性单克隆于3ml含有抗生素的LB液体培养基中，37度，200转，过夜培养！

　　为了不破坏细胞内存在的蛋白与蛋白之间的相互作用,多采用非离子变性剂(NP-40或TritonX-100),不能采用高浓度的变性剂(0。2%SDS),细胞裂解液中要添加各种酶的抑制剂！（16）超声破碎,频率:100~200瓦;超声40秒,停止20秒,共5次(菌体由浑浊变为澄清);（17）4°C,15000rpm离心40分钟;（18）冰上转移细胞裂解液上清至洁净的10mL离心管中;（19）在细胞裂解液上清中加入50μL50%GlutathioneSepharose4B,4°C,静音混合器上温和旋转孵育30–60分钟;（20）3000rpm离心5分钟,弃上清,此时Sepharose上即结合了GST融合蛋白或GST;（21）在管中加入预冷的500μLPBS(沿壁加入,动作轻柔,以免打断珠子与蛋白的联接),轻晃悬浮珠子,将Sepharose洗涤1次,3000rpm离心3分钟,弃上清;（22）反复用PBS洗涤3次(最后用小枪吸净珠子表面水膜),即获得结合有GST融合蛋白或GST的Sepharose,用大口径的移液枪头转移至5mL尖底离心管中;（23）如果用于检测,在Sepharose加入15–20μL1xSDS蛋白上样缓冲液,在沸水中煮3分钟,12000rpm离心1分钟,取上清作SDS-PAGE电泳;（24）如果用于Pull-down检测,继续后续操作！

正宗西北GST-pull down技术服务

　　▼背景说明蛋白互作在细胞生命活动中起着关键作用,在不同时空层面上参与多种细胞过程,因此研究蛋白互作对于理解分子调控网络至关重要.通常情况下,利用酵母双杂交系统筛选植物蛋白互作必须利用体外和体内系统进行验证!Pull-down就是验证植物蛋白互作的常用技术，被广泛用于体外验证蛋白间的直接互作.▼应用场景Pull-down技术,也叫蛋白质体外结合实验,是一种行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术.▼实验原理将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽标记的珠子上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液与之孵育,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,诱饵蛋白和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得.

高品质西北GST-pull down技术服务

　　50%GSTSepharose4Bslurry的准备（11）将原75%GlutathioneSepharose4Bslurry弹至均匀;（12）取677μL原液/管,3000rpm,离心5分钟,弃上清;（13）加500μLPBS,颠倒混匀,3000rpm,离心5分钟,弃上清,反复5次;（14）加500μLPBS,颠倒混匀,配成50%GlutathioneSepharose4B备用!100mMIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：38gIPTG溶于100mlddH2O中，0!

我们推荐西北GST-pull down技术服务

　　GST-Pulldown是在体外验证两种蛋白质结合的方法之一，其原理是目的蛋白与GST融合表达，蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支持物，起到“诱饵蛋白”的作用。目标蛋白溶液通过柱子，从中可以捕获相互作用的“捕获蛋白”（目标蛋白）.结合物洗脱后，通过蛋白质印迹(WB)分析证实了两种蛋白质之间的相互作用.“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”都可以通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录和翻译系统获得，这种方法简单易操作。由于高端分析仪器技术要求高，研发周期长，研发投入大，对于国内企业来讲是个巨大的挑战。虽然近几年出现了像聚光科技、普析通用、天瑞仪器、东西电子、北京纳克、雪迪龙、河北先河等这样快速发展的高新技术企业，但是国内企业仍然普遍缺少高端产品原始创新能力，缺乏自有技术，研发投入力度严重不足，工作缺乏系统性和长期连续性，导致国内企业高端分析仪器开发能力不足。科研院所、大专院校的科研成果与产业的衔接渠道不畅，短期内还无法生产出满足国内市场需求的高端分析仪器。