D.4℃，12000rpm离心30分钟.收集上清液。E.取20µL上清，加入loadingbuffer，煮蛋白后SDS凝胶电泳，以考马斯亮兰染色检测蛋白表达!留40µL裂解液作为input！GST融合蛋白的纯化：A。清洗beads:用含0!1%TritonX-100的BC100缓冲液洗20µLGST-sepharosebeads，5000rpm离心30秒2次，共清洗3次!B！重悬beads:以BC100缓冲液1：1重悬GST-sepharosebeads.

　　22μm滤膜抽滤，-20℃保存！3GST融合蛋白的纯化（15）从–80°C冰箱中拿出冻存的样品,冰浴溶解菌体后,加入4mLPBS和40μLPMSF(100mmol！L–1)和40μL蛋白酶抑制剂Cocktail(100X)进行充分重悬;（还有这种做法：每升菌液约以50mLPBS重悬，加入1%TritonX-100（v/v），1％β-巯基乙醇（v/v），PMSF（终浓度1mM））细胞裂解需要采用温和的裂解条件（问下天地人和细胞裂解液配方GST的）!

　　在Pull-down实验中,设计恰当的对照实验非常重要,该对照可以是表达有GST(非诱饵融合蛋白)的转化细胞裂解物,也可以是将GST加到非转化细胞的裂解物中.GST融合蛋白Pull-down的方法可以用来鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质,也可以鉴定2个已知蛋白质之间是否存在相互作用.此方法简单易行,操作方便！但Pull-down的结果并不能真实的反应蛋白质之间的相互作用,因为在活体内它们不一定在亚细胞空间上能碰到,所以并不意味着在生理条件下一定结合！

郑州GST-pull down技术服务

　　▼背景说明蛋白互作在细胞生命活动中起着关键作用,在不同时空层面上参与多种细胞过程,因此研究蛋白互作对于理解分子调控网络至关重要!通常情况下,利用酵母双杂交系统筛选植物蛋白互作必须利用体外和体内系统进行验证.Pull-down就是验证植物蛋白互作的常用技术，被广泛用于体外验证蛋白间的直接互作.▼应用场景Pull-down技术,也叫蛋白质体外结合实验,是一种行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术！▼实验原理将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽标记的珠子上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液与之孵育,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,诱饵蛋白和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得！

　　实验操作流程如下：诱导与转化：将制备好的分别带GST和His标签的质粒转化至BL21感受态细胞中A！质粒加入细菌B。冰上30minC!42℃水浴5s或1minD。向转化混合物中加入500µLLB，不加抗生素，160rpm37℃摇床振荡1hE.涂板隔夜培养；pGEX用A板，pET用K板F!挑选阳性克隆（引物根据自己做的质粒选择）G！将阳性克隆加入至3mLLB培养液，220rpm37℃过夜小摇H！取200µL菌液加入20mLLB培养液（50mL离心管内），1:1000分别加入氨苄西林（pGEX）及卡那霉素（pET-28a）220rpm37℃4-6小时I。

　　C！孵育蛋白：将GST融合蛋白裂解液加入洗涤后的GST-sepharosebeads中！4℃震荡孵育1小时！D。收集beads:5000rpm离心30秒，两次，沉淀beads!E！清洗beads:吸出上清，用1mLBC500缓冲液（含1%TritonX-100，不含蛋白酶抑制剂）清洗beads3次！5000rpm离心30秒，两次，沉淀beads!F!清洗beads:以1mLBC100缓冲液（含0。1%TritonX-100，不含蛋白酶抑制剂）清洗beads3次。