GST-Pulldown是在体外验证两种蛋白质结合的方法之一，其原理是目的蛋白与GST融合表达，蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支持物，起到“诱饵蛋白”的作用。目标蛋白溶液通过柱子，从中可以捕获相互作用的“捕获蛋白”（目标蛋白）。结合物洗脱后，通过蛋白质印迹(WB)分析证实了两种蛋白质之间的相互作用。“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”都可以通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录和翻译系统获得，这种方法简单易操作。实验操作流程如下：1.诱导与转化：将制备好的分别带GST和His标签的质粒转化至BL21感受态细胞中A.质粒加入细菌B.冰上30minC.42℃水浴5s或1minD.向转化混合物中加入500µLLB，不加抗生素，160rpm37℃摇床振荡1hE.涂板隔夜培养；pGEX用A板，pET用K板F.挑选阳性克隆（引物根据自己做的质粒选择）G.将阳性克隆加入至3mLLB培养液，220rpm37℃过夜小摇H.取200µL菌液加入20mLLB培养液（50mL离心管内），1:1000分别加入氨苄西林（pGEX）及卡那霉素（pET-28a）220rpm37℃4-6小时I.菌液呈浑浊状后检测OD值，OD值0.6时加入0.5mM的IPTG，继续摇菌4小时J.5000rpm离心10min后收集菌体，去除上清2.裂解细菌：A.向菌体中加入1mL含1x蛋白酶抑制剂的BC100缓冲液（不含TritonX-100）重新悬浮细菌。B.将步骤A中的菌体悬液转移至1.5mLEP管中，置于冰上。超声裂解细菌，超声30秒，冰上静置30秒，共反复5次。C.超声后加入110µL10%TritonX-100,4℃震荡1h。D.4℃，12000rpm离心30分钟。收集上清液。E.取20µL上清，加入loadingbuffer，煮蛋白后SDS凝胶电泳，以考马斯亮兰染色检测蛋白表达。留40µL裂解液作为input。3.GST融合蛋白的纯化：A.清洗beads:用含0.1%TritonX-100的BC100缓冲液洗20µLGST-sepharosebeads，5000rpm离心30秒2次，共清洗3次。B.重悬beads:以BC100缓冲液1：1重悬GST-sepharosebeads。C.孵育蛋白：将GST融合蛋白裂解液加入洗涤后的GST-sepharosebeads中。4℃震荡孵育1小时。D.收集beads:5000rpm离心30秒，两次，沉淀beads。E.清洗beads:吸出上清，用1mLBC500缓冲液（含1%TritonX-100，不含蛋白酶抑制剂）清洗beads3次。5000rpm离心30秒，两次，沉淀beads。F.清洗beads:以1mLBC100缓冲液（含0.1%TritonX-100，不含蛋白酶抑制剂）清洗beads3次。5000rpm离心30秒，两次，沉淀beadsG.以300µLBC100缓冲液重悬beads（含0.1%TritonX-100）。4.His融合蛋白的纯化：采用His-taggedproteinpurificationMagbeads（Absin,中国）进行His融合蛋白的纯化，按照制造商的使用说明进行操作。A.取0.3mL的磁珠，磁性分离，washingbuffer清洗3次。B.细菌裂解液加入磁珠中，4℃震荡孵育1小时，washingbuffer清洗3次，每次清洗后均磁性分离磁珠。C.在磁珠中加入400µLElutionbuffer，室温震荡2分钟，磁性分离收集洗液。反复3次。D.将3次中收集到的液体用10K的超滤管进行浓缩，5000g，离心15分钟，加入500µLBC100缓冲液进行缓冲液置换，5000g，离心15分钟，收集到50-100µL浓缩蛋白。5.蛋白结合及检测：A.纯化蛋白结合：向GST及GST-DNMT3Lbeads中分别加入10µLHis-USP46纯化蛋白，4℃震荡孵育1小时，5000rpm离心30秒，两次，沉淀beads。B.吸出上清。以1mLBC100缓冲液（含0.1%TritonX-100）清洗beads3次。C.加入1xloadingbuffer50µL，连同input样本，95℃金属浴5min。离心分离beads，取上清进行Westernblot检测。

(1)实验前准备。包括纯化重组蛋白及合成DNA探针。(2)标记探针。在合成的DNA探针上标记放射性同位素32P或生物素。由于生物素不具有放射性以及便于操作等优点,近年来人们常使用生物素标记DNA探针。按照以下顺序配制标记组和竞争组的反应体系。标记组:12.5μL超纯水,5μL5×TdT缓冲液,2.5μL1μmol∙L–1未标记的Oligo,2.5μL5μmol∙L–1Biotin-11-UTP,2.5μL2U∙μL–1DilutedTdT。竞争组:20μL超纯水,2.5μL10×结合缓冲液(含Mg2),2.5μL50μmol∙L–1未标记的Oligo。37°C避光孵育30分钟。加入1.25μL0.2mol∙L–1EDTA终止反应,然后加入25μL氯仿:异戊醇(1:1),旋涡振荡混匀,16000×g离心1–2分钟,取上清。随后转移至90°C孵育2分钟,缓慢降温至60°C,最后于60°C孵育30分钟。(3)6%TBE凝胶制备及预电泳。按照配方依次加入各成分并充分混匀,注意在灌胶过程中要防止气泡的产生。待TBE凝胶完全凝固后开始预电泳,90V电泳1–2小时,电泳缓冲液为0.5×TBE缓冲液。(4)蛋白与探针结合反应。按照以下配方配制结合反应体系。实验组:50ng融合蛋白,0.5–2μL标记探针,6μL结合反应缓冲液,用超纯水定容至20μL。竞争组:50ng融合蛋白,0.5–2μL标记探针,过量的野生型未标记探针或突变型未标记探针,6μL结合反应缓冲液,用超纯水定容至20μL。其中,结合缓冲液的配方为:2μL10×结合缓冲液,1μL50%丙三醇,1μL100mmol∙L–1MgCl2,1μL1μg∙μL–1PolydI:dC,1μL1%NP-40。通常未标记野生型或突变型探针的用量为标记探针的10倍、50倍和100倍。PolydI:dC可抑制蛋白与DNA的非特异性结合,避免形成假复合物。(5)电泳。结合反应完毕后加入5μL上样缓冲液,充分混匀再进行上样。电压90V,待指示剂到达胶的3/4处时即可停止电泳。(6)转膜。将尼龙膜小心取出,放入0.5×TBE转膜缓冲液中,依次按照黑面-纤维垫-2层滤纸-胶-尼龙膜-2层滤纸-纤维垫-白面的顺序放置,注意不要有气泡产生。380mA工作60分钟。(7)紫外交联。取出尼龙膜用吸水纸吸干水,蛋白面朝下放入紫外交联仪中,紫外交联15分钟。(8)发光检测。将紫外交联后的尼龙膜置于干净的平皿中,加入10mL封闭缓冲液,轻柔摇动15分钟。轻轻倒掉封闭缓冲液,加入8mL结合/封闭缓冲液,轻柔摇动15分钟。将尼龙膜转移至新的平皿中,加入10mL1×漂洗液,轻柔漂洗5分钟,重复漂洗3次。将尼龙膜转移至新的平皿中,加入15mL底物平衡缓冲液,轻柔摇动15分钟。取出尼龙膜,吸干多余的底物平衡缓冲液,置于新的平皿中。加入6mL化学发光底物至完全覆盖尼龙膜,静置孵育5分钟。最后,取出尼龙膜,从侧面吸干多余的化学发光底物,用保鲜膜包被,在化学发光成像系统(Bio-step)中曝光5分钟进行显影。(9)数据分析。通常情况下,可以从两方面分析EMSA数据,即底部的自由探针和位于上方的迁移条带(蛋白-DNA复合物)。在加入等量标记探针的前提下,当蛋白与DNA产生互作时,底部的自由探针减少,迁移条带亮度增强。在此基础上增加未标记野生型探针会与标记探针竞争蛋白,此时自由探针条带强度基本不变,迁移条带亮度减弱;而当增加未标记的突变探针时,由于蛋白不结合该序列,突变探针不与标记探针竞争,此时自由探针减少,迁移条带亮度增强(Jiangetal.,2016)。

背景说明DNApulldown以感兴趣的DNA序列为中心，寻找与该序列结合的蛋白质，比较常见的应用是寻找某特定基因启动子的转录因子。启动子通常位于结构基因5"端上游，含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。转录因子也称反式作用因子，是一种DNA结合蛋白，它能与真核基因的顺式作用元件（如启动子、增强子等）特异性结合来激活或抑制基因表达。转录因子有4个主要结构域：DNA结合域决定转录因子的特异性，转录调控域（包括激活域或抑制域）决定转录因子的功能，寡聚化位点使不同转录因子间发生相互作用，核定位信号控制转录因子进入细胞核。一个基因的启动子通常会结合多种转录因子，寻找启动子的特异转录因子，有助于我们理解这些启动子下游的功能基因是如何被调控的。▼应用场景DNApulldown用于研究DNA结合蛋白和特定的DNA序列的相互作用。▼实验原理DNApulldown是一种研究DNA与蛋白互作的方法。其原理是：生物素标记的DNA片段结合在链霉亲和素磁珠上，再与核蛋白孵育，从而捕获并纯化出与DNA片段互作的蛋白。捕获的蛋白一方面可以通过Westernblot验证某一特定蛋白是否与靶DNA片段结合；另一方面也可以进行质谱鉴定，筛选出与DNA片段可能互作的蛋白质。▼我们的优势1.表达蛋白时有自研改造的适合不同蛋白表达的标签载体，确保表达出可溶性蛋白；2.原核表达对培养基、温度、ph、时间、分子伴侣等进行优化组合，确保可溶性蛋白产量；3.添加各种裂解液和蛋白酶抑制剂的超声破碎缓冲液，确保蛋白产量；4.自研的超滤缓冲液配方，保护蛋白且不影响蛋白和DNA结合；5.Thermo原装试剂标记探针，保证标记效率；6.自研的洗杂液配方，确保非特异结合蛋白的流出7.自研的洗脱液配方，确保生物素探针的完全洗脱8.自研封闭液和洗涤液，降低实验背景。

基本原理在验证植物蛋白互作时，荧光素酶互补实验(LuciferaseComplementationAssay,LCA)因其高灵敏度、可定量化、操作简单高效被广泛应用于植物学和动物学蛋白质互作研究目前,应用广泛的荧火素酶基因来源于北美萤火虫(fireflyluciferase),该基因编码550个氨基酸组成的荧火素酶蛋白(大小为62kDa)。实验中,荧光素酶蛋白被切成N端和C端2个功能片段,即NLuc(2–416AA)和CLuc(398–550AA)。在一个实验体系中,待检测的2个目标蛋白分别与NLuc和CLuc融合,如果2个目标蛋白相互作用,则荧火素酶的NLuc和CLuc在空间上会足够靠近并正确组装,从而发挥荧火素酶活性,即分解底物产生荧光。Abstract:Protein-Proteininteractionsplayimportantrolesinvariouseukaryoticbiologicalprocesses.Comparedtoothertechniquesmeasuringprotein-proteininteractionsinplants,theLuciferaseComplementationAssay(LCA),basedonAgrobacterium-mediatedtransientexpressioninNicotianabenthamiana,isasensitive,reliable,highlyquantitativeandlowbackgroundmethodthatcanbeeasilyscaledupforhigh-throughputinteractomestudies.Here,wedescribeaprotocolthatincludestwoalternativedatacollectionmethodstoqualitativeandquantitativeanalyseluminescenceorluminousintensitytodetectprotein-proteininteractionsinplantcells.

双荧光素酶报告基因实验（luciferaseAssay）目前由两个主要的应用方向，一是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用，转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合，这些特异性的序列被称为顺式因子，转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferaseAssay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，第二是研究微小RNA(microRNA)对于靶基因的调控，通过生物信息学方法预测microRNA潜在的靶基因以及干预位点序列，并设计合适的microRNA质粒或干预片段，同时构建靶基因的报告基因质粒，二者同时转染细胞，这是确定microRNA是否能影响（上调或下调）靶基因的首选研究方法。实验原理：1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic（转录因子与靶基因）或pMIR-REPORTLuciferase质粒（微小RNA与靶基因）2）将要检测的转录因子表达质粒（或microRNA质粒）与报告基因质粒共转染293细胞或目的细胞。如果此转录因子（或microRNA）能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光素，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

实验原理：在荧光蛋白（YFP、GFP、Luciferase等）的两个β片层之间的环结构上有许多特异性位点可以插入外源蛋白而不影响荧光蛋白的荧光活性.BiFC技术正是利用荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白融合表达。BiFC技术正是利用荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白融合表达。如果两个目标蛋白因物理相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成有活性的荧光基团而发出荧光。实验目的：在烟草植株活体细胞中检测蛋白质-蛋白质相互作用。交付结果：实验流程和共聚焦图片等结题报告（电子版）服务周期30个工作日。

一、实验原理：免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）以抗体和抗原之间的专一性作用为基础，用于研究两个蛋白质在活体细胞内生理性相互作用的经典的方法。当活体细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，与X在细胞内结合的蛋白质Y可以与蛋白质X一起以复合物的形式被沉淀下来，然后经Westernblot或质谱的方法对蛋白质Y进行检测或鉴定。二、实验目的：确定两种目标蛋白质是否在活体细胞体内相互作用，也可用于确定一种特定蛋白质的新的相互作用搭档。三、操作步骤：1.适用范围依据抗体类型（蛋白质X自身特异性抗体、蛋白质X融合商品化标签抗体）。本方法试例举：蛋白质X融合FLAG标签，将该载体转基因转入水稻获得稳定转基因植株，然后用FLAG标签抗体利用Co-IP方法沉淀与蛋白质X互作的蛋白质复合物，用Westernblot方法检测蛋白质Y是否一起被沉淀下来，以确定在水稻体内蛋白质X和蛋白质Y是否真正相互作用。2.取水稻叶片5g，经液氮研磨后，加入3倍体积蛋白IP缓冲液，在4°C混匀30min。3.于4°C，12,000g离心30min，将上清转移至一个预冷的新的离心管中。4.用0.22µm滤膜过滤上清，取过滤的50µl上清作为Input，用于蛋白质X的检测。5.Anti-FLAGM2AffinityGel预处理。取出50µl预混匀的Anti-FLAGM2AffinityGel转移至一预冷的离心管中。于4°C，4,000rpm离心1min，小心将上清吸取弃之。加入20倍体积预冷的TBS缓冲液以平衡Gel，于4°C，4,000rpm离心1min，小心将上清吸取弃之；重复3次。于4°C，12,000rpm离心15s，小心将上清吸取弃之。6.取蛋白质加入到已平衡化的Anti-FLAGM2AffinityGel中，于4°C孵育。7.洗脱Gel。于4°C，4,000rpm离心1min，小心将上清吸取弃之。加入1,500µl预冷的IP缓冲液洗脱Gel，于4°C孵育5min，4,000rpm离心1min，小心将上清吸取弃之；如此重复3次。于4°C，12,000rpm离心15s，小心将上清吸取弃之。8.加入约40µl2倍上样缓冲液，100°C变性5min，稍离心，取适量体积进行Westernblot实验，分别用商品化FLAG标签抗体和蛋白质Y抗体进行检测。

产品介绍:实时荧光定量PCR技术（Real-timePCR）是在常规PCR技术基础上发展而来的一种核酸定量技术。其基本原理是在常规PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，从而对PCR产物进行实时监测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析和检测.相较于常规PCR而言，实时荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量分析，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点.

实验原理及目的染色质免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用最为主要的方法之一。本实验的原理是在活细胞状态下通过化学交联剂将蛋白质－DNA复合物固定，并将其随机打断成一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学的方法沉淀出目的蛋白质－DNA复合体，从而特异性地富集与目的蛋白相结合的DNA片段。通过对目的DNA片断的纯化与检测，最终获得蛋白质与DNA相互作用的信息。染色质免疫共沉淀技术广泛的应用于表观遗传（组蛋白等）分析，转录因子结合位点分析等蛋白质与DNA结合的试验分析中。随着第二代测序技术的逐步完善和成熟，染色质免疫共沉淀结合第二代高通量测序技术（ChIP-seq）正逐步成为基因调控网络研究中一种非常有效的研究手段。

在获得想要的DNA片段之后，使用合适的载体可以对这些片段进行操作，实现想做的研究。目前，本公司有很多载体供大家进行各类实验，一般情况下，大家只需要选择并找到合适的载体就可以了。少数情况下，可能会涉及到需要对载体进行改造。方法通过酶切将DNA片段连入载体实验原理DNA连接酶可以催化相邻DNA链的5‘磷酸基团与3‘羟基形成磷酸二酯键，从而完成连接。常见的依赖限制性内切酶的连接，是将载体和目标DNA片段（外源片段）进行相同方式的酶，产生可以互补配对的粘性末端，然后进行连接。根据使用的酶数量，可以分成双酶切、单酶切两种类型。

拟南芥原生质体亚细胞定位一、实验原理：将目标蛋白基因与荧光蛋白的N端或C端融合，通过瞬时转染技术，使得该融合蛋白在受体细胞内表达，目标蛋白会牵引荧光蛋白一起定位到目标细胞器中，通过观察荧光蛋白在细胞内显示的位置，确定目标蛋白的位置，从而确定目标蛋白的亚细胞定位情况。二、实验步骤：1、去内毒素质粒提取2、亚细胞定位实验（一）准备拟南芥幼苗（二）拟南芥原生质体的制备（三）PEG转化（室温操作）三、实验结果：激光共聚焦拍照。烟草亚细胞定位一、实验原理：利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达，进行蛋白的亚细胞定位实验。二、实验步骤：1.农杆菌培养2.本生烟草（Nicotianabenthamiana）注射农杆菌菌液3.取样，激光共聚焦拍照。

Invitrogen核/膜系统一、实验原理：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由DNA结合结构域(DNA—bindingdomain，BD)和转录激活结构域(activationdomain，AD)。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。在GAL4系统中构建与基因的ORFs融合的激活结构域GAL4-AD的特异载体，顺式作用元件与GAL4的DNA结合结构域GAL4-BD融合构建载体，分别转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若与顺式作用元件发生相互作用时，就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起，从而与上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)结合，激活相应报告基因的表达，在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。基因转录实际上是转录调控因子和启动子区各种顺式作用元件相互作用的结果，这种结合犹如蛋白质与蛋白质的互作一样具有特异性，这是研究顺式作用元件即DNA序列与蛋白质互作的基础。

Invitrogen核/膜系统一、实验原理：酵母双杂交系统是在酵母体内通过重建有活性转录因子的结构来鉴定蛋白质之间的相互作用。转录因子可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录.另外实验详情和步骤都做了阐述。这种DNA结合与转录激活的功能是由转录因子上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(BindingDomain,BD)和转录激活结构域(ActivationDomain,AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录激活都是必须的。