EMSA结合反应结合反应体系为：2μl的10×Bindingbuffer、1μl的Poly(dIdC)、5μl的SGC7901Nuclearextract（6μg/μl）、2μl的BiotinProbe（约15fmol/μl）、2μl的Antibody、ddH2O补齐20μl.另外，使用过量未标记的冷探针进行竞争性实验，即4ul的WT-probe（约15fmol/μl）；使用突变探针4μl的(Mut-probe)（约15fmol/μl）作为对照。

　　25%胰酶溶液均购自美国Gibco公司；ChemiluminescentNucleicAcidDetectionModule、LightShiftChemilinescentEMSAKit为美国Thermoscientific公司产品；NuclearExtractKit为ActiveMotifNorthAmerica公司产品。方法凝胶迁移阻滞实验的具体操作步骤如下：制备生物素标记探针1)。在Invitrogen公司合成探针序列，见下表!

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　　在此基础上增加未标记野生型探针会与标记探针竞争蛋白,此时自由探针条带强度基本不变,迁移条带亮度减弱;而当增加未标记的突变探针时,由于蛋白不结合该序列,突变探针不与标记探针竞争,此时自由探针减少,迁移条带亮度增强(Jiangetal!,2016)!1)将结合反应的混合物用无菌枪头轻轻的混合均匀，置于冰上反应20min，然后加入生物素标记的探针；室温继续反应20min，加入6×LoadingBuffer(Takara)4μl，上样体积为10~30μl，100V电泳至溴酚蓝于四分之三凝胶处；2)进行电转前将NC膜浸泡于新鲜配制的0!

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　　取出尼龙膜,吸干多余的底物平衡缓冲液,置于新的平皿中.加入6mL化学发光底物至完全覆盖尼龙膜,静置孵育5分钟!最后,取出尼龙膜,从侧面吸干多余的化学发光底物,用保鲜膜包被,在化学发光成像系统(Bio-step)中曝光5分钟进行显影。数据分析。通常情况下,可以从两方面分析EMSA数据,即底部的自由探针和位于上方的迁移条带(蛋白-DNA复合物)!在加入等量标记探针的前提下,当蛋白与DNA产生互作时,底部的自由探针减少,迁移条带亮度增强。

　　待TBE凝胶完全凝固后开始预电泳,90V电泳1–2小时,电泳缓冲液为0！5×TBE缓冲液!蛋白与探针结合反应！按照以下配方配制结合反应体系.实验组:50ng融合蛋白,0!5–2μL标记探针,6μL结合反应缓冲液,用超纯水定容至20μL!竞争组:50ng融合蛋白,0.5–2μL标记探针,过量的野生型未标记探针或突变型未标记探针,6μL结合反应缓冲液,用超纯水定容至20μL！其中,结合缓冲液的配方为:2μL10×结合缓冲液,1μL50%丙三醇,1μL100mmol∙L–1MgCl2,1μL1μg∙μL–1PolydI:dC,1μL1%NP-40.