菌液呈浑浊状后检测OD值，OD值0.6时加入0.5mM的IPTG，继续摇菌4小时J!5000rpm离心10min后收集菌体，去除上清裂解细菌：A。向菌体中加入1mL含1x蛋白酶抑制剂的BC100缓冲液（不含TritonX-100）重新悬浮细菌！B！将步骤A中的菌体悬液转移至5mLEP管中，置于冰上。超声裂解细菌，超声30秒，冰上静置30秒，共反复5次！C!超声后加入110µL10%TritonX-100,4℃震荡1h！

　　C.在磁珠中加入400µLElutionbuffer，室温震荡2分钟，磁性分离收集洗液！反复3次。D！将3次中收集到的液体用10K的超滤管进行浓缩，5000g，离心15分钟，加入500µLBC100缓冲液进行缓冲液置换，5000g，离心15分钟，收集到50-100µL浓缩蛋白。蛋白结合及检测：A!纯化蛋白结合：向GST及GST-DNMT3Lbeads中分别加入10µLHis-USP46纯化蛋白，4℃震荡孵育1小时，5000rpm离心30秒，两次，沉淀beads。

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　　在Pull-down实验中,设计恰当的对照实验非常重要,该对照可以是表达有GST(非诱饵融合蛋白)的转化细胞裂解物,也可以是将GST加到非转化细胞的裂解物中!GST融合蛋白Pull-down的方法可以用来鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质,也可以鉴定2个已知蛋白质之间是否存在相互作用!此方法简单易行,操作方便！但Pull-down的结果并不能真实的反应蛋白质之间的相互作用,因为在活体内它们不一定在亚细胞空间上能碰到,所以并不意味着在生理条件下一定结合！

　　50%GSTSepharose4Bslurry的准备（11）将原75%GlutathioneSepharose4Bslurry弹至均匀;（12）取677μL原液/管,3000rpm,离心5分钟,弃上清;（13）加500μLPBS,颠倒混匀,3000rpm,离心5分钟,弃上清,反复5次;（14）加500μLPBS,颠倒混匀,配成50%GlutathioneSepharose4B备用.100mMIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：38gIPTG溶于100mlddH2O中，0!

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　　将过夜培养的3ml菌液接入300ml（1:100）含有抗生素的LB液体培养基中，37度，200转，5-3h，摇至OD600=0.8左右。取出0！5ml菌液于4度保存作为诱导前菌液。同时在剩余菌液中加入终浓度为1mM/L的IPTG，16-27度，100-200转，诱导8-16h!诱导后取出0！5mL菌液于4°C保存作为诱导后菌液;4°C,6000rpm,离心15分钟,收集诱导后菌体,用20mLPBS溶液重悬菌体后,转移至50mL离心管中;4°C,6000rpm,10分钟,倒掉上清,液氮速冻,–80°C保存用于纯化;4°C,10000rpm,2分钟,收集诱导前菌液和诱导后菌液,用80μL1XSDS上样缓冲液重悬菌体;（10）100°C,煮沸样品5分钟,12000rpm,离心2分钟,取上清对诱导结果进行SDS-PAGE检测.

　　D.4℃，12000rpm离心30分钟.收集上清液！E！取20µL上清，加入loadingbuffer，煮蛋白后SDS凝胶电泳，以考马斯亮兰染色检测蛋白表达!留40µL裂解液作为input！GST融合蛋白的纯化：A。清洗beads:用含0!1%TritonX-100的BC100缓冲液洗20µLGST-sepharosebeads，5000rpm离心30秒2次，共清洗3次！B。重悬beads:以BC100缓冲液1：1重悬GST-sepharosebeads.

　　GST-Pulldown是在体外验证两种蛋白质结合的方法之一，其原理是目的蛋白与GST融合表达，蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支持物，起到“诱饵蛋白”的作用。目标蛋白溶液通过柱子，从中可以捕获相互作用的“捕获蛋白”（目标蛋白）!结合物洗脱后，通过蛋白质印迹(WB)分析证实了两种蛋白质之间的相互作用.“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”都可以通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录和翻译系统获得，这种方法简单易操作！