在低生物分子浓度（例如5µM）下，SPAAC由于适度的动力学（例如0!3至3M–1s–1）而不足，并且铜催化的炔烃-叠氮化物环加成点击反应可能会危及系统的生存能力，反式-环辛烯-四嗪（TCO–Tz）是选择的反应对。这种连接化学是基于反式环辛烯和四嗪反应对之间的逆需求Diels-Alder环加成反应，形成二氢哒嗪键（图4）!化学选择性TCO–Tz连接对具有任何其他生物正交连接对都无法比拟的超快动力学（800M–1s–1）!

　　因此，只有一小部分化学转化适用于在环境温度下在pH中性的水性环境中对高度官能化的生物分子（如蛋白质、核酸和糖）进行生物正交连接，同时仍保持生物功能.适合特定应用的特定连接策略的选择基于不同的因素！铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应（CuAAC）的使用*限于铜毒性不重要的应用（例如肽或寡修饰，或细胞裂解物标记）!在这方面，菌株促进的炔烃-叠氮化物环加成反应（SPAAC）更适合生物偶联，因为不需要催化剂或额外的试剂。

　　产物形成的二阶速率常数越高，在合理的时间尺度内，在接近中性的pH下，在低反应物浓度下，在不需要使用大量过量的情况下，偶联就越有效任何一种生物分子!生物正交反应物在10µM下的二阶速率常数（M–1s–1）与随时间变化的共轭产率百分比之间的关系如图2所示.反应物的另一个重要的生物偶联特征是它们具有化学选择性！也就是说，在其他生物官能团（例如氨基（-NH2）、羧基（-COOH）和/或硫醇（-SH））的丰富环境中，彼此之间具有选择性反应性！

　　超快动力学、选择性和长期水稳定性的结合使TCO–Tz成为低浓度应用（如蛋白质-蛋白质）的理想配对结合。示例应用程序使用20倍摩尔过量的四嗪-PEG5–NHS酯在BupH缓冲液（pH5）中标记五个山羊IgG样品（100µL，5mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL和1mg/mL）！类似地，在BupH缓冲液（pH5）中以0mg/mL的浓度标记0.1mLHRP（500µg），使用将20倍摩尔过量的TCO–PEG4–NHS酯持续60分钟.

　　这一重要特征经常被忽视，然而，缺乏选择性是通过不必要和非选择性的分子内相互作用进行自共轭（同源二聚体形成）的驱动力.最后，重要的是化学反应性官能团具有生物相容性!连接反应在与生物分子相容的温和水性缓冲条件下进行是至关重要的，而不需要对生物系统具有高毒性的催化试剂（例如Cu（I））。生物正交化学官能团必须在长期水储存期间保持高度反应性但稳定，同时对高浓度的其他生物官能团保持惰性！不幸的是，只有少数化学转化符合这些严格定义的条件：反应性、选择性和生物相容性。

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　　然而，SPAAC反应的反应速率本身就很低（例如0.1至0.9M–1s–1），限制了它们在相对高浓度应用中的使用（例如蛋白质-小分子偶联、细胞标记）.对于低生物分子浓度（例如5µM）的应用，逆需Diels-Alder连接对反式-环辛烯-四嗪（TCO–Tz）是一对选择!化学选择性TCO–Tz连接对具有任何其他生物正交连接对都无法比拟的超快动力学（800M–1s–1）。超快动力学、选择性和长期水稳定性的结合使TCO–Tz成为低浓度应用（如蛋白质-蛋白质偶联）的理想配对！